酶标诊断试剂盒操作中出现的问题和解决办法
酶标（ELISA，EIA）诊断试剂盒操作中出现的问题和解决办法现象 可能原因 纠正方法
（一）显色淡、灵敏度偏低 1、试剂盒没有按规定保存，受高温影响 不要将试剂盒长时间置于室温下，按使用规定储藏
2、试剂盒超过有效期 不要使用
3、试剂、样品使用前未能平衡 用前试剂、样品置室温平衡30分钟
4、移液器计量不准，吸嘴(tips)不清洁或含水份 校正移液器，移液器与吸嘴配合要紧密吻合，移液不宜太快，排放应完全，吸嘴最好一次性使用
5、恒温箱或孵育温度不到37C 注意温度并及时调节，不宜多打开机盖
6、保温时间不够 要准确定时
7、洗涤冲击力太大，洗液浸泡时间太长，洗涤次数过多 按说明书要求注意控制洗涤冲击力，洗涤时间和洗涤次数
8、显色剂加量不足或顺序颠倒或A、B液混合后加入 滴加显色剂时滴瓶应垂直，持力均匀，先加A再加B，不可混合后加入；必要时用移液器加液
9、底物（显色液）作用时间不够 准确定时
10、蒸馏水水质有问题 测定蒸馏水水质
11、样品用了防腐剂(NaN3)，抑制了酶的反应 样品不能用防腐剂
(二)重复性差 1、样品数量不一，加样时间长短不一 重复某一样品时，加样尽可能与第一次接近
2、样品加入后未混匀 加样后充分混匀（或混匀后加样）
3、酶标滤光片不对或输入波长不对 TMB用450/630，PNPP用405/630波长
4、酶标仪测定重复性差 校对酶标仪并注意清洁
5、洗涤不正确 自动洗板时不应有堵孔，洗涤液注满各孔而又不要溢出，洗涤充分，残留量少
6、温育条件不一致（一次水浴，一次用温箱） 恒温较水浴显色深
7、不慎多加或少加酶或显色剂，操作过程个别孔液体外溅，酶、显色剂滴于孔壁上 多加显色深，少加则浅，防止液体外溅，用吸水纸吸干孔壁上残留的酶或显色剂
8、不同批号试剂盒中组份混淆使用 尽量不要将不同批号试剂混合使用
9、阈值附近时阴时阳 同一样品做三个或多个复孔，以二个以上相同者为准
10、加样量、保温时间、洗涤、操作人员不一致 近可能使用同一移液器和装紧吸嘴重复测定标本，条件、人员应尽量与上次保持一致
（三）阳性对照不显色，出现一片白 1、蒸馏水有问题 与好的蒸馏水比较
2、洗液配制有误 按说明书配制
3、终止液误作洗液稀释或当底物缓冲液配制 每次配制时注意看请试剂标签
4、漏加酶或显色剂 不要漏加，注意观察液面高度
5、某一容器未洗净，残留有灭活酶物质 使用的容器要洁净、可靠
（四）全部呈有色 1、水质问题 防止蒸馏水污染
2、加酶量过多 注意检查移液器及设定加样量
3、温度超过37C，或酶结合时间或显色时间超过 注意温度和时间
4、洗涤不充分，样品中有其它成分残留，或有残留酶 充分洗涤，减少残留
5、底物（显色液）配制时间过长，受光照或受污染 按说明书严格操作并需避光
6、样品放置时间过长，污染 样品应保持新鲜，或低温保存，防止污染
7、移液吸嘴重复使用，未洗净或消毒不完全而用于加酶或底物 吸嘴尽可能一次性使用
（五）花板 1、操作不慎 按说明书洗板，加样，显色
2、洗针堵孔，残留液较多，加或吸洗液不均匀 检查洗针并进行调整
3、样品离心处理不完全，有凝血或残留细胞成分 离心3000rpm6分钟以上
（六）显色顺序前后不均 样品量过大，加试剂时间过长，反应时间不一致（特别是对于反应时间短的试剂盒） 注意控制加样的时间注意：
1、 不同厂家生产的试剂盒因生产工艺和操作方法略有不同，请用户务必按照所用试剂盒严格操作，否则容易产生检测结果的不确定性。
2、 若不同批号试剂的不同组分（A液或酶工作液），或不同试剂的不同组分进行交叉使用，有可能出现显色浅或本底高，花板等情形。
3、 加样时样品量误差，对于阴或很阳的标本影响不大，但对阈值附近的标本影响极大，建议校对加样器。
4、 反应时间的误差，做大量标本时，第一孔和最后一孔以及一些特殊标本可能影响较大。
5、 由于滴瓶的精密性肯定不如加样器，不排除不同滴头滴量的误差。另外滴加过程中是否产生气泡、速度是否均匀，是否颤动等影响液量的因素均可导致以上情况。高标准要求时应使用加样器。
6、 阈值附近实际上是个灰区（gray scale）,不能截然分为阴性、阳性，国外厂家均要求对这部分可疑标本进行奇数次复检，以次数多者为准，如一次阳两次阴最后判为阴，但实际上是否为阴不好说，只有判为可疑，临床上可以让患者过一段时间后再测。
7、 肉眼观察稍显色，酶标仪打印为阴性的标本在实际工作中是难以避免的，肉眼目测结果不可靠，应以酶标仪判读为准。
8、 由阴性变为强阳性原因多为操作过程中漏加试剂等有关。
9、 临界值附近标本波动为正常现象，任何试剂均不可避免。可以考虑将标本做奇数次复检。
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